准备：首先将内层灭菌桶取出，在向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。一般来说，每次灭菌前都应加水。

放回灭菌内桶，并装入待灭菌物品：将准备灭菌的培养基及空玻璃器皿用牛皮纸包好，装入锅内套层中。

加盖：先检查锅盖上的密封圈是否良好，并去除污物，再将锅盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。也有些不是用螺栓，而是像家庭使用的高压锅一样，只要将锅盖与锅的槽口对准，顺时针转动，卡到位即可。

用电炉或煤气加热(大部分用电热管加热)，并同时打开排气阀，以便锅内水沸腾后排出锅内的冷空气。这里要特别注意，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要。因为空气的膨胀压力大于水蒸汽的膨胀压力，所以当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含有空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。通常应等锅内水烧开后排气3~5min，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。另一种排除冷空气的方法是：按上述方法盖紧锅盖，加热使锅内产生蒸汽。当压力表指针达到33.78kPa时，打开排气阀将冷空气排出，此时压力表指针下降。当指针下降至零时，冷空气排尽，关上排气阀。当锅内压力上升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

达到灭菌所需时间后，切断电源或关闭煤气。让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力下降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开锅盖，10min后取出灭菌物品。千万要注意，如果压力未降到0就打开排气阀，会因锅内压力突然下降，使容器内的液体由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。